研究证明 | NK细胞保存时间最好不超过24小时

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导语 / Introduction

4 °C条件下，NK细胞和NKT细胞保存时间最好不超过24h，且以生理盐水+5%人血白蛋白+1%低分子右旋糖苷保存效果最佳。

随着免疫细胞生物学的快速发展，免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要手段之一。

细胞免疫治疗疗法，又称为过继免疫治疗，是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力。

用于细胞免疫治疗疗法的免疫细胞主要有自然杀伤细胞(NK细胞）、自然杀伤T细胞(NKT细胞）等。

细胞收集后，需要用保存液重悬再由实验室转运到临床。因自体免疫细胞治疗是个体化治疗，细胞制品与普通的生物制品和药品不同，如何在运输过程中保持免疫细胞的最大活性及其原有生物学性质，确保最终应用于治疗的细胞达到统一的质量标准成为了免疫治疗的关键。

免疫治疗已成为肿瘤治疗最具价值和潜力的治疗手段

从2011年美国洛克菲勒大学教授Ralph M.Steinman因“发现树突状细胞及其在获得性免疫中的作用”而获得诺贝生理学或医学奖到2013年Science杂志把肿瘤免疫治疗列为年度重大科学突破，再到发现以PD1为核心药物的免疫检查点抑制剂疗效更显著，世界范围内已经掀起了开发免疫疗法的热潮，免疫治疗已成为肿瘤治疗最具价值和潜力的治疗手段。

NK细胞是机体重要的天然免疫细胞，占外周血淋巴细胞的比例约10%~20%。它不仅参与免疫调节，也与抗肿瘤密切相关。

近年来，越来越多的研究证明了NK细胞加入了抗癌行列。NKT细胞是体内重要的执行免疫调节功能的特殊的T淋巴细胞亚群，通过分泌细胞因子来调节免疫系统的功能。因此在体外得到高增殖活性的NK和NKT细胞，然后回输给免疫系统功能低下的机体，可增强体内免疫监视和清除功能，提高机体抗衰老的能力，降低疾病风险。

无论临床应用哪种免疫细胞治疗疾病，都必须遵循《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行）》，为临床免疫细胞治疗提供安全有效的细胞产品。

随着肿瘤免疫细胞治疗的飞速发展，细胞进行短时内的保存和运输势必会越来越频繁。如何最大限度保证短期内保存袋内的细胞生物学特性不发生变化是许多实验室人员的探索目标。这其中包括保存液的成分、保存的时间和温度等。已有大量实验证明，无论是免疫细胞还是干细胞，在4℃恒温条件细胞状态最好。

不同的细胞保存液对自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞短期保存的影响

南方医科大学实验管理中心、佛山科学技术学院医学院等机构组成的科研团队在行业专业期刊Journal of Shenyang Medical College上发表了题为《不同的细胞保存液对自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞短期保存的影响》的研究成果。

该报告指出，为了探讨4C运输保存条件下，自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞在不同的保存液中保存0、6、12、24h后其生物学性质的变化，为开展免疫细胞保存运输提供可靠的实验依据。

研究人员采集4份40ml血液标本，将同一外周血来源的细胞分别按照NK细胞、NKT细胞培养方案分成2份培养。将已经培养好的8份NK细胞、NKT细胞分别收集并应用生理盐水（保存液A）、生理盐水+5%人血白蛋白(保存液B）、生理盐水+5%人血白蛋白+1%低分子右旋糖苷（保存液C）3种保存液分别保存。于0、6、12、24h分别进行细胞活率及结团率、流式细胞术检测及细胞杀伤实验检测。

结果：存放12h时，A组的细胞活率已低于85%，与其他2组比较差异有统计学意义（P<0.05）；存放24h时，各组细胞活率均低于85%，但A组保存液中的细胞活率明显低于B、C组（P<0.05）。存放12、24h时，B组和C组保存液中细胞结团率均低于A组，且存放24h时，C组的结团率低于B组（P<0.05）。直至24h，各处理组中流式细胞术检测结果均未出现明显变化。存放12h时NK细胞和NKT细胞的A组细胞与C组比较，杀伤作用明显减弱（P<0.05）；随着保存时间的延长，至24h各组细胞的杀伤力均出现显著下降，A组、B组细胞的杀伤力与C组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

结论：4℃条件下，NK细胞和NKT细胞保存时间最好不超过24h，且以生理盐水+5%人血白蛋白+1%低分子右旋糖苷保存效果最佳。

总之，该研究通过对不同保存液中NK细胞和NKT细胞在4℃条件下短期保存的活率、结团率及杀伤力等方面影响的探讨，发现NK细胞和NKT细胞在生理盐水+5%HSA+1%低分子右旋糖苷保存液中存放效果最佳，但也不应超过24h。此次研究为免疫细胞保存的科学性、标准化做了探索并提供了科研依据。

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来源：干细胞与外泌体

审校：咏彤

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